STAR Protocols丨湯常永團隊發(fā)表基于慢病毒調控基因表達評估成年嚙齒動物神經(jīng)發(fā)生和認知功能的實驗方案
成體神經(jīng)發(fā)生是神經(jīng)干細胞（Neural stem cells, NSCs）產(chǎn)生功能性新生神經(jīng)元的過程，其主要發(fā)生在海馬齒狀回(Dentate gyrus, DG)的顆粒細胞層下區(qū)和側腦室下區(qū)[1]。其中，成體海馬神經(jīng)發(fā)生（Adult hippocampal neurogenesis, AHN）異常被認為是導致神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)精神性疾病認知功能障礙關鍵因素[1-2]。目前，各種研究成體神經(jīng)發(fā)生異常的分子機制方法迥異，不能統(tǒng)一評估和有效復制；因此，急需建立一套相對完整、高效和簡潔的標準化研究方案。
2023年11月28日，中山大學附屬第三醫(yī)院（以下簡稱：中山三院）湯常永團隊受邀在Cell子刊STAR Protocols在線發(fā)表了題為“Protocol for lentivirus-mediated delivery of genes to study neurogenesis and cognitive function in adult rodents”的實驗方案文章（Protocol）。該文章展示了一套相對完整的實驗流程，包括構建包裝含有目標基因（多效生長因子[Pleiotrophin, PTN]）的慢病毒，利用腦立體定位注射技術向海馬齒狀回注射慢病毒，評估海馬成體神經(jīng)發(fā)生，以及實施認知功能相關行為學測試。這一實驗流程為該領域科研人員研究AHN的分子機制提供一種簡潔且系統(tǒng)的實驗方案。此前，湯常永團隊已運用本實驗方案進行了衰老相關的海馬神經(jīng)發(fā)生衰退及相關認知功能障礙分子機理的研究，相關研究成果發(fā)表于Cell Reports?(2023)[3]。
?
△原文鏈接?https://doi.org/10.1016/j.xpro.2023.102761
?
參考文獻
1.Li, Y., et al. Neural Stem Cell Niche and Adult Neurogenesis. Neuroscientist. 2021; 27: 235–245.
2.Anacker, C., et al. Adult hippocampal neurogenesis and cognitive flexibility - linking memory and mood. Nat. Rev. Neurosci. 2017; 18: 335–346.
3.Li H, et al. Pleiotrophin ameliorates age-induced adult hippocampal neurogenesis decline and cognitive dysfunction. Cell Rep. 2023;42(9):113022.
論文梗概
在本研究方案中，作者以PTN為例，詳細闡述了PTN過表達慢病毒構建、海馬DG區(qū)立體定位注射、神經(jīng)發(fā)生評估（EdU和BrdU注射）、組織免疫熒光處理和認知行為學測試的實驗流程（圖1）。
△圖1：神經(jīng)發(fā)生相關動物體內實驗方案流程圖（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
作者首先詳細描述了過表達PTN慢病毒的構建方法，即：使用目標質粒CAG-PTN-2A-GFP和3個包裝質粒（VSVG，pMDLg和pRSV-Rev）按一定比例混合后，利用轉染試劑聚乙烯亞胺（Polyethylenimine， PEI)，以HEK293T細胞為媒介，依次通過連續(xù)收集含有病毒的細胞培養(yǎng)基上清、負壓過濾、超速離心、病毒滴度測定等步驟，構建過表達PTN的高滴度慢病毒（圖2）。
△圖2：過表達PTN慢病毒構建示意圖（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
然后，通過查閱相關資料，確定小鼠海馬DG區(qū)坐標：以前囟為0點，向后2.0 mm，中線旁開1.7 mm，深度1.9 mm；利用小動物氣體麻醉機對老年小鼠（12月齡）進行誘導麻醉和維持麻醉，再將小鼠固定于操作臺，剔除頭部毛發(fā)后使用數(shù)字化立體定位儀標記坐標；完成以上術前準備后，使用顱鉆打孔，通過顯微注射器勻速注入慢病毒后留針5分鐘，接著縫合傷口完成整個海馬DG區(qū)的病毒注射；最后將術后小鼠置于小動物電熱毯進行麻醉復蘇，密切關注小鼠生命體征，待小鼠舒醒后，放回干凈鼠籠（圖3）。
△圖3：成年小鼠海馬齒狀回慢病毒立體定位注射的主要手術器械和關鍵步驟（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
接著，將一批老年小鼠在術后1周取材前2小時進行腹腔注射EdU，從而標記具有增殖能力的NSCs，以評估過表達PTN對NSCs增殖能力（GFP+EDU+GFAP+細胞）的影響。同時，手術3天后對另一批老年小鼠進行連續(xù)4天的腹腔注射BrdU來標記NSCs，然后分別在第2周末和第4周末對小鼠進行取材，通過組織免疫熒光染色對比過表達PTN組小鼠和對照組小鼠海馬區(qū)的新生未成熟神經(jīng)元（GFP+BrdU+DCX+細胞）和新生神經(jīng)元（GFP+BrdU+NeuN+細胞）的數(shù)量，進而反映過表達PTN能夠提高NSCs向神經(jīng)元分化的潛能（圖4）。
△圖4：PTN能夠促進成年小鼠海馬區(qū)NSCs的增殖和神經(jīng)元向分化（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
最后，在術后4周時，對2組剩余的老年小鼠進行認知功能相關行為學測試，包括傳統(tǒng)水迷宮（Morris Water Maze, MWM）實驗和反向水迷宮（Reverse Morris Water Maze, RMWM）實驗，分別比較2組小鼠找到平臺的潛伏期和穿越目標象限的次數(shù)；結果表明，過表達PTN組的小鼠總體表現(xiàn)更好，提示PTN能夠改善老年小鼠的認知功能減退（圖5）。
△圖5：PTN能夠改善年齡相關的認知功能減退（圖源: Xu, et al.,?STAR Protoc. 2023）
?
結論與討論
綜上所述，在這項工作中，作者詳細描述了一套評估動物體內神經(jīng)發(fā)生的系統(tǒng)性實驗流程。通過構建載運目標基因的慢病毒，靶向海馬DG區(qū)進行立體定位注射，借助EdU和BrdU方法標記NSCs，利用免疫熒光檢測海馬DG區(qū)組織等有效評估了特定基因對AHN的關鍵作用；同時，輔以行為學測試，進一步從功能學層面揭示了目標基因的具體影響。該方法有利于全面評估AHN，為研究AHN的分子機制提供了標準化實驗方案。
研究團隊
中山三院徐莉博士研究生為本文第一作者，湯常永為通訊作者；該研究得到了中山三院李浩洋、姜維、徐輝明等同學的幫助。此外，該研究得到了中山三院神經(jīng)內科陸正齊、邱偉，實驗醫(yī)學部韓曉燕及丘秀生等教授的支持和幫助。
△照片提供自湯常永團隊
通訊作者簡介：湯常永，中山大學附屬第三醫(yī)院副研究員，中山大學“百人計劃”引進人才。2019年畢業(yè)于中國科學院遺傳與發(fā)育生物研究所并獲得神經(jīng)生物學專業(yè)博士學位，布朗大學博士后。曾獲得北京市優(yōu)秀畢業(yè)生、中科院優(yōu)秀畢業(yè)生、中科院院長優(yōu)秀獎等獎勵。主要研究神經(jīng)干細胞和星形膠質細胞及其微環(huán)境在神經(jīng)退行性疾病（如衰老、AD等）和神經(jīng)免疫性疾病（如NMOSD、MS等）中的作用。近年來在Science Advance?(2023)，Molecular Therapy?(2023)，Cell reports?(2023, 2019)，Neuron?(2019)，Molecular Psychiatry?(2021)，Glia?(2022),?STAR Protocols?(2020, 2023)等雜志發(fā)表多篇學術論文，并主持國家自然基金、科技創(chuàng)新-2030腦計劃青年項目（課題骨干）、廣州市基礎與應用基礎科學基金等多個科研項目。
?
